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| Affiche pour Journée Carrière - 2017 | ||
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Electrophorèse capillaire (CE) et la chromatographie électrocinétique capillaire (EKC) : études fondamentales et les applications L'électrophorèse capillaire (EC) regroupe plusieures techniques microséparatives à haute résolution réalisées dans les capillaires de silice fondue ayant les diametres de 75 µm ou moins. Vue notre intérêt dans la séparation des peptides, nous étudions les moyens d’améliorer la séparation des mélanges complexes de peptides. L’ajout de différents modificateurs au tampon de fond change le mécanisme de séparation. Nous utilisons les surfactants pour faire l’EKC micellaire et les cyclodextrines pour la séparation des énantiomères. Développement des microréacteurs d’enzyme immobilisée La carte peptidique utilisant une enzyme protéolytique est un outil bioanalytique souvent utilisé afin de caractériser les protéines par l’identification des anomalies d’un acide aminé constituant un peptide. Par contre, le plus gros désavantage d’une enzyme protéolytique soluble est son autoprotéolyse donnant des pics non voulus sur la carte peptidique. Afin d’éviter cela, les enzymes protéolytiques insolubles sont utilisées pour possiblement éliminer ces pics. Les travaux précédents du groupe ont démontré qu’il est possible d’immobiliser la trypsine par réticulation polymérique avec le glutaraldéhyde et de digérer les protéines standards dans des courts périodes de temps. Nous voulons produire un microréacteur d’enzymes immobilisées par la glutaraldéhyde afin de pouvoir produire rapidement et efficacement, à l’échelle capillaire, des cartes peptidiques utiles à l’étude des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles. Un microréacteur à phase solide serait utile parce qu’il peut être relié à un système de séparation, tel que l’électrophorèse capillaire, afin d’automatiser la digestion enzymatique. Afin d’évaluer la performance de ces microréacteurs une méthode de CE-LIF est développée en parallèle. Le but du groupe serait de développer et caractériser un tel appareil intégré pour le clivage rapide et efficace des protéines suivi de la cartographie peptidique par CE et aussi par la chromatographie liquide capillaire. La microencapsulation est une autre technique d’immobilisation d’enzymes par rapport à l’immobilisation sur des billes de verre, ou la réticulation, car la cavité intérieure des capsules crée un microenvironnement aqueux qui permet de protéger l’enzyme du milieu extérieur de façon à maintenir son activité et sa stabilité. En collaboration avec le groupe de recherche du Prof. Dominic Rochefort, notre objectif est d’étudier l’efficacité de la microencapsulation, pour réaliser à longue terme un microréacteur couplé « en-ligne » à un système d’électrophorèse capillaire (EC). Nous étudions l’action de l’enzyme Laccase sur un substrat modèle, l’ortho-phenylènediamine (OPD). L’évaluation de l’activité enzymatique de la Laccase libre et microencapsulée par rapport à l’OPD se fait par des techniques électroanalytiques (cellule à O2) et par spectroscopie (absorbance UV/VIS). Une méthode en EC est en développement pour la séparation/quantification de l’OPD et son produit d’oxydation, le 2,3-diaminophenazine (DAP). La quantification de la réaction enzymatique est importante afin d’évaluer l’efficacité de ces enzymes immobilisées dans des biocapteurs et bioréacteurs.
Développement des méthodes de détection à base de laser ultraviolet pour l’électrophorèse capillaire L’analyse de molécules biologiques bénéficie, depuis quelques décennies, du développement de nouvelles techniques, dont l’électrophorèse capillaire (CE). Malheureusement, le petit chemin optique (50 μm) habituellement utilisé pour détecter les composées séparées en CE nuit fortement à la limite de détection par absorbance moléculaire classique dans l’ultraviolet-visible. La limite de détection en mol/L en CE avec ce type de détection est d’un ordre de grandeur plus élevé que pour la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Bien que la détection par fluorescence induite par laser (LIF) soit hautement sensible pour la CE, elle requiert, dans la majorité des cas, une dérivation des analytes avec un fluorophore. Ceci rend l’analyse des composés, à la concentration trace, laborieuse. Notre groupe s’intéresse donc au développement des méthodes de détection à base de laser pour améliorer la limite de détection en CE par: a) la détection par absorbance thermo-optique (TOA), qui est une méthode indépendante du chemin optique pouvant être utilisée pour toutes les molécules qui absorbent au moins légèrement à la longueur d’onde d’excitation utilisée, et b) la LIF native des molécules qui fluorescent dans leurs forme natif, tels que les acides aminés aromatiques tryptophane et tyrosine.
Développement des méthodes chromatographiques Notre groupe développe les méthodes LC and GC pour un variété d'applications en collaboration avec le Centre regional de spectrométrie de masse à l'UdeM. Par exemple, dans un de nos projets, on visait à identifier les composantes provenant de la fumée de cigarette présentant un effet toxicologique. L’acide chlorogénique est un polyphénol et un constituant majeur de la feuille de tabac et d’autres aliments (des pommes, grain de café, etc.). Les produits de sa combustion ont montrés une certaine biotoxicité dans les études antérieures. La première phase de notre projet était de relier la toxicité des produits de combustion de l’acide chlorogénique à sa composition chimique. Des techniques analytiques comme la fractionation par LC, l’HPLC-MS et la GC-MS sont utilisées à cette fin, ainsi que les méthodes toxicologiques telles que le test in-vitro de micronucléus (IVMNT) pour mesurer la prolifération de cellules et la cytotoxicité. La seconde phase de notre projet visait à appliquer les techniques développées pour l’acide chlorogénique à l’analyse de la fumée entière. Des méthodes HILIC (la chromatographie liquide hydrophilique) couplées à la MS sont en développement pour la séparation des composants dans les solvants utilisés pour la capture de carbone. Tels solvants sont typiquement basés sur les composés aminés et donc les techniques classiques de la chromatographie en phase inversée ne sont pas adéquates pour séparer les espèces tellement polaires. Nous avions appliqué la HILIC dans un projet impliquant le chitosan. Les oligosaccharides de chitosane sont des formes entièrement ou partiellement déacétylées des oligosaccharides de chitine retrouvés dans les déchets de la pêche. Nos collaborateurs en biochimie, incluant le groupe de Prof. Joelle Pelletier, développent une enzyme déacétylase mutante provenant d’une souche Axe A afin de remplacer le procédé chimique actuellement utilisé. Les enzymes mutantes produisent des espèces de degrés de déacétylation variés dont des isomères positionnels. Notre objectif est de développer une méthode rapide de criblage pour ces produits de réaction enzymatique, permettant ainsi d’orienter les prochaines mutations. La chromatographie liquide avec détection par spectrométrie de masse (LC-MS) est une technique analytique puissante avec laquelle les produits de déacétylation du substrat d’hexa-saccharide de chitine ont été identifiés. La spectrométrie de masse nous permet d’analyser les oligosaccharides sous forme native puisqu’ils sont aisément ionisés par nébulisation électrostatique (ESI). Nos recherches actuelles se concentrent sur l’optimisation de la méthode pour la séparation des oligosaccharides selon le degré de déacétylation et de polymérisation. De plus, une méthode de CE-LIF nous permet actuellement de séparer des oligosaccharides de chitin et chitosan dérivés avec APTS.
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