Schizosaccharomyces pombe

Protocoles

Protocole Co-IPP

  1. Plater S.pombe possédant l'insert dans le MM DO595=0.3-0.9 (milieu du log) à 30ºC avec agitation 260 rpm
  2. Récupérer 10 mL de DO595 0,8
  3. Ajuster le volume à 10 mL si les cellules sont sous 0,8
  4. Traiter avec différentes conditions de stress pendant 2 heures :
    • Heat shock 39ºC
    • Tunicamycine 10 ug/ml (Ci 10 mg/ml) à 30ºC 5 ul/5ml
    • DTT 10 mM (Ci 1M) à 30ºC 50 ul/5ml

Toujours à 4ºC :

  1. Ajouter directement le NaN3 (Ci 1.538 M) pour une concentration finale de 10 mM (32.5 ul/ml)
  2. Centrifuger au froid 5 min à 5000 rpm.
  3. Resuspendre le culot dans 150 ul de IPP Buffer (voir plus haut) plus froid pmsf (à 1 mM from 200 mM), IAA (10 mM à partir de 0.5 M) et le cocktail d'inhibiteurs de protéases (à partir de x100, voir plus haut)
  4. Ajouter 250 µl de billes de verre et traiter au beadbeater 4 fois 30 secondes ou 10 fois 30 secondes avec le vibrobroyeur à vitesse maximale et laisser 30 secondes sur glace (pour cette étape, utiliser des tubes à bouchon qui visse)
  5. Ajouter 400 ul de IPP Buffer plus
  6. Centrifuger à 13000 rpm pendant 5 min
  7. Retirer 400 ul de surnageant dans un nouveau tube
  8. Ajouter 400 ul de IPP Buffer plus et resuspendre le culot gentiment
  9. Centrifuger à 13000 rpm pendant 5 min
  10. Prélever le surnageant (400 ul)
  11. Centrifuger (800 ul) 13000 rpm pendant 18 min et retirer le surnageant
  12. Ajouter 50 ul de 10 % Protein A-sepharose. Agiter légèrement 30-60 min à 4ºC (étape préliminaire)
  13. Centrifuger 21 min à 13000 rpm, prélever le supernatant et centrifuger de nouveau 25 minutes
  14. Calculer la concentration de protéines par Bradford.
  15. Ajouter dans un volume total de 800 ul, 2 ul de @calnexin (d=1/400) LAR224 (Preimm 204 ou 205)
  16. Incuber 1 heure à 4ºC avec une légère agitation
  17. Ajouter 50 ul de Protein-A Sepharose (à 10% dans le IPP buffer plus) (1 g de protéine A dans 10 ml) et laisser 1 heure à 4oC
  18. Centrifuger 2 min à 13000 rpm, et retirer le surnageant par aspiration
  19. Laver quatre fois dans 1 ml de IPP buffer (sans inhibiteurs de protéases contenant le IAA et le PMSF comme plutôt). Pendant le lavage, centrifuger 5 min à 13000 rpm et placer sur le rocker pour 3 min
  20. Retirer le surnageant et ajouter 75 ul pour un gros gel ou 30 ul pour un petit gel de sample buffer 5X (voir protocole de Bio Rad) + 5% beta-EtOH. Le tampon devrait contenir le bleu de bromophénol.
  21. Bouillir l'échantillon 5 min, centrifuger 5 min à 12000 rpm, et charger le surnageant sur le gel de protéines.

Modifié à partir d'un protocole de Co-IPP de AM, PBB, PLT (07/10/2002)