Schizosaccharomyces pombe

Protocoles

Extraction de plasmide de levures (Glassbeads-Column) :

  1. Saturer une culture de 10 mL. Culoter par centrifugation. Décanter le surnageant et resuspendre les cellules dans le liquide résiduel. Transférer dans un tube à microcentrifugeuse.
  2. Centrifuger 2 min (13 000 rpm) dans le tube. Jeter le surnageant.
  3. Ajouter 100 µL de tampon de lyse, 100 uL de phenol:chloroforme (50:50) et les billes de verre. Vortexer 5-10 min.
  4. Ajouter 100 µL de TE (pH 8). Centrifuger 8 min (13 000 rpm). Transférer la phase aqueuse dans un eppendorf (~200 µL).
  5. Ajouter un volume égal de chloroforme. Mélanger par inversion, centrifuger 2 min (13 000 rpm). Transférer la phase aqueuse dans un nouvel eppendorf.
  6. Ajouter un volume égale de tampon N3, mélanger par inversion.
  7. Transférer le lysat dans une colonne QIAprep Spin Column. Centrifuger 30-60s (13 000 rpm). Jeter le liquide.
  8. Nettoyer la colonne QIAprep en ajoutant 750 µL de Buffer PE et centrifuger 30-60s (13 000 rpm).
  9. Jeter le liquide et centrifuger pour 1 min additionnelle afin d'enlever tout le liquide résiduel (13 000 rpm).
  10. Placer la clonne QIAprep Spin Column dans un eppendorf propre. Pour éluer l'ADN ajouter 50 uL d'eau dans le centre de chaque colonne, puis centrifuger 1 min.
Protocole modifié à partir de :
Preparing Chromosomal DNA (alternative method); Hoffman & Winston; Gene 57, 267-272 (1987)
et Isolation of plasmid DNA from yeast using the QIAprep Spin Miniprep Kit; www.qiagene.com/literature/handbooks/default.asp